干細(xì)胞移植是一種對(duì)多種疾病有效的治療方法，但是對(duì)于干細(xì)胞移植后在體內(nèi)的生物學(xué)行為所知甚少，使其臨床應(yīng)用在目前仍受到相當(dāng)?shù)南拗啤m內(nèi)移植是近年來發(fā)展起來的一種干細(xì)胞移植技術(shù)，它將移植的時(shí)間推前到胎兒時(shí)期，由于胎兒早期的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，因此對(duì)移植的外源細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受性而不予以排斥，也不需要移植后進(jìn)行免疫移植治療。干細(xì)胞宮內(nèi)移植作為一種新的產(chǎn)前治療手段，對(duì)一些目前難以根治的先天性/遺傳性疾病的治療提供了一種新的手段。

干細(xì)胞移植是一種對(duì)多種疾病有效的治療方法，但是對(duì)于干細(xì)胞移植后在體內(nèi)的生物學(xué)行為所知甚少，特別是由于難以尋找到合適配型的供者、移植后常出現(xiàn)的宿主抗移植物反應(yīng)和需長期進(jìn)行免疫抑制治療等問題，使其臨床應(yīng)用在目前仍受到相當(dāng)?shù)南拗啤m內(nèi)移植是近年來發(fā)展起來的一種干細(xì)胞移植技術(shù)，它將移植的時(shí)間推前到胎兒時(shí)期，由于胎兒早期的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，因此對(duì)移植的外源細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受性而不予以排斥，也不需要移植后進(jìn)行免疫移植治療。干細(xì)胞宮內(nèi)移植作為一種新的產(chǎn)前治療手段，對(duì)一些目前難以根治的先天性/遺傳性疾病的治療提供了一種新的手段，此外，通過干細(xì)胞宮內(nèi)移植技術(shù)構(gòu)建人/動(dòng)物嵌合體對(duì)深入研究人干細(xì)胞在體內(nèi)的歸巢、分化、基因表達(dá)特征、可塑性和組織損傷的修復(fù)等提供了新的思路和良好的模型。本成果開展了以下幾個(gè)方面的工作：

簡要技術(shù)

1.在B－超監(jiān)視下，通過人源干細(xì)胞宮內(nèi)移植途徑進(jìn)行了大規(guī)模的人/山羊異種移植嵌合體的研制，首次建立了人/山羊嵌合體動(dòng)物模型，在B超監(jiān)視和引導(dǎo)下，將來源于人臍帶血CD34＋Lin－細(xì)胞注射到孕期為45—65天的胎山羊腹中，定期用B超觀察胎羊的生長發(fā)育情況，并觀察母羊的生理反應(yīng)和免疫耐受情況。胎羊出生后，綜合應(yīng)用分子生物學(xué)、分子細(xì)胞遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫組織化學(xué)等技術(shù)證明人源干細(xì)胞可在山羊體內(nèi)長期存活，目前已獲得32頭嵌合體山羊，人源細(xì)胞在山羊體內(nèi)存活的最長時(shí)間已達(dá)2年以上。

2.開展了嵌合體山羊體內(nèi)人源細(xì)胞多器官移植存活、分化和基因表達(dá)特征的研究。為探討宮內(nèi)移植的人源干細(xì)胞在山羊體內(nèi)的分布和分化情況，構(gòu)建了含有綠色熒光蛋白（GFP）報(bào)告基因反轉(zhuǎn)錄病毒載體并將其轉(zhuǎn)導(dǎo)到人造血干細(xì)胞中（GFP+細(xì)胞），進(jìn)行山羊?qū)m內(nèi)移植獲得人/山羊嵌合體，然后綜合應(yīng)用FACS、PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、RT－PCR、FISH和免疫組化等方法在人/山羊嵌合體活體水平追蹤和觀察人源細(xì)胞的體內(nèi)行為特征。結(jié)果顯示，人源干細(xì)胞在山羊的血液、肝、腎、肌肉、肺等器官高比例的歸巢并分化成相應(yīng)的人的組織細(xì)胞（如人肝樣細(xì)胞，表達(dá)人血清白蛋白、人肝細(xì)胞特異抗原和人肝核因子等），顯示了廣泛的可塑性。

3.開展了干細(xì)胞可塑性機(jī)制的研究。應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選經(jīng)灌流的嵌合體山羊肝臟中的人源細(xì)胞(GFP+細(xì)胞)，經(jīng)過分子生物學(xué)技術(shù)鑒定，證明存在于山羊體內(nèi)的GFP+細(xì)胞確實(shí)是人細(xì)胞；表明移植于山羊體內(nèi)的人源干細(xì)胞的可塑性并非由細(xì)胞融合機(jī)制所致。

4.應(yīng)用基因芯片分析了人/山羊嵌合體中人源基因的表達(dá)譜。應(yīng)用AffymetrixU133A基因芯片系統(tǒng)地分析了嵌合體山羊血液和肝臟組織人源基因表達(dá)譜，結(jié)果顯示在血液和肝臟中分別有133種和86種人源基因（包括信號(hào)傳導(dǎo)、膜和受體蛋白以及轉(zhuǎn)錄因子等不同類別的基因）高度表達(dá)，這一結(jié)果經(jīng)實(shí)時(shí)定量RT-PCR和/或DNA測(cè)序證實(shí)，從而為檢測(cè)來源自人造血干細(xì)胞的活細(xì)胞在體內(nèi)的基因表達(dá)特征提供了一種新的特異的標(biāo)記。

5.構(gòu)建了更昔洛韋（GCV）可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)HSV－tk基因小鼠肝損傷動(dòng)物模型和異體或異種移植嵌合體小鼠模型，活體水平證明造血干細(xì)胞宮內(nèi)移植可有效的修復(fù)肝損傷，構(gòu)建了轉(zhuǎn)HSV－tk基因小鼠肝損傷物動(dòng)模型，然后在胎鼠妊娠12天時(shí)通過宮內(nèi)移植干細(xì)胞的技術(shù)獲得具有異體或異種（人）細(xì)胞的嵌合體小鼠模型，小鼠出生后利用GCV誘導(dǎo)特異肝損傷，并通過血液生化，肝臟免疫組織化學(xué)，分子檢測(cè)等分析外源干細(xì)胞在受體肝臟的增殖與對(duì)肝損傷修復(fù)情況，結(jié)果顯示，大部分宮內(nèi)移植陽性鼠在GCV處理后，血清生化學(xué)指標(biāo)，如AST，ALT和ALP等沒有明顯改變，損傷28天后通過肝臟病理學(xué)分析也證實(shí)移植鼠肝結(jié)構(gòu)基本正常，未見灶性壞死，炎性細(xì)胞浸潤增生等肝臟損傷組織病理形態(tài)學(xué)變化，PCR結(jié)果表明肝臟存在供體細(xì)胞。異種異體嵌合模型的RT－PCR和免疫組織化學(xué)結(jié)果也顯示有相應(yīng)人源肝臟特異基因的mRNA表達(dá)和肝特異蛋白的存在，提示宮內(nèi)注射的供體細(xì)胞在損傷條件下可能歸巢到肝臟并在肝臟增殖，參與損傷肝的修復(fù)和再生，從而對(duì)肝損傷有保護(hù)效果。

技術(shù)創(chuàng)新

1.首次獲得了人/山羊異種移植嵌合體，建立的B超監(jiān)視下于山羊孕早期（45—65天）進(jìn)行人成體干細(xì)胞宮內(nèi)移植，具有創(chuàng)傷低、排異率低、成功率高等優(yōu)點(diǎn)；

2.首次應(yīng)用山羊作為大動(dòng)物進(jìn)行人成體干細(xì)胞異種移植的模型來生產(chǎn)和貯存人源性造血細(xì)胞和肝臟細(xì)胞；

3.首次應(yīng)用GFP標(biāo)記來分析人體干細(xì)胞在山羊活體內(nèi)的生物學(xué)行為特征；

4.綜合應(yīng)用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、組織學(xué)等多學(xué)科技術(shù)，系統(tǒng)地研究嵌合體山羊體內(nèi)人源細(xì)胞的分化和表達(dá)特征；

5.首次應(yīng)用基因芯片分析人/山羊嵌合體的人源基因的表達(dá)譜；

6.首次將肝臟損傷與干細(xì)胞宮內(nèi)移植結(jié)合起來進(jìn)行肝損傷治療的研究，為肝臟疾病的治療提供了新的思路和技術(shù)途徑。

應(yīng)用前景

含有高比例人源細(xì)胞的人/動(dòng)物嵌合體具有以下理論和實(shí)際意義：

1.為研究干細(xì)胞在活體內(nèi)的生物學(xué)行為提供新的思路和材料來源；

2.為實(shí)現(xiàn)異種器官移植和細(xì)胞治療提供豐富的物質(zhì)基礎(chǔ)和材料來源；

3.為通過干細(xì)胞宮內(nèi)移植進(jìn)行疾病的產(chǎn)前治療提供理論和技術(shù)手段；

4.以人/動(dòng)物嵌合體的器官（如肝臟）作為生物反應(yīng)器，為人源蛋白的生產(chǎn)開辟了新的途徑。